Einführung

Sample Vorbereitung

RNA-Seq Pipeline

Wirkungsweise

  • Aktuell zugelassen bei Leber-, Nieren- und Schilddrüsenkarzinom
  • Multikinase-Inhibitor
    • Hemmung von Serin-/Threonin-Kinasen (z. B. B-RAF, C-RAF)
    • Hemmung von Rezeptor-Tyrosinkinasen (assoziiert mit verschiedenen Wachstumsfaktoren)
  • Wirkungen:
    • ⇓ Zellvermehrung und –überleben
    • ⇓ Angiogenese
    • ⇑ Zelluläre Stressantwort
    • ⇑ Apoptose
  • Zugelassen bei Melanom und nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom (mit BRAF-V600-Mutation)
  • Selektive Hemmung der Kinasen MEK1 und MEK2 ⇒ Hemmung des MAPK-Signalweges
  • Wirkung auf Tumorzellen ähnlich wie Sorafenib, aber selektiver

Analyse

Ziel:
Unterschiede in der Genexpression finden

  • Statistischer Test zum Finden von Unterschieden:
    1. Aufstellen einer Nullhypothese H0: kein Unterschied
    2. Gegenhypothese: Es gibt einen Unterschied
  • Negative Binominalverteilung zur Modellierung der Counts (Varianz besser abbildbar)
  • Fold Change = Wert Bedingung (Sora) / Wert Bedingung (DMSO)
  • Log Fold Change hat Vorteile beim Rechnen (Linear / Additiv)

Vorbereitung

  1. Erstellen einer Count-Matrix und Annotation mit Zusatzbezeichnungen
  2. Filtern der Daten (69% werden verworfen, 31% behalten)
  3. Erstellen des DeSeq2-Objekts für die weitere Analyse
  4. Transformieren und Normalisieren der Beobachtungen zur Beseitigung der technischen Variablilität und Vergleichbarkeit der Genexpressionsniveaus zwischen Proben (Gen-Länge vs. Sequenziertiefe):

Count-Daten

  • Kaum Unterschiede zu nicht-normalisierten Daten
  • Gute Datenqualität

Explorative Analyse

Strukturfindung

Optimale Anzahl Komponenten für PCA

  • Nur Top 500 Gene miteinbezogen
  • 2-3 Komponenten optimal

  • Klare Separierbarkeit entlang PC1
  • Stabile Kontrollgruppe
  • Sora deutlich von DMSO unterschieden
  • Tram deutlich heterogener (sollte untersucht werden)
  • Problem: Misst nur linearen Zusammenhang
  • PC3 erklärt nur knapp 7% der Gesamtvarianz
  • Keine bessere Separabilität

t-distributed Stochastic Neighbor Embedding

  • Misst lokalen nicht-linearen Zusammenhang
  • Deutliche Cluster der drei Treatments
  • Trametinib kohärenter als bei PCA

Uniform Manifold Approximation and Projection

  • Misst lokalen und globalen Zusammenhang
  • “Gradientenstruktur” DMSO → Tram → Sora
  • Problem: Zu wenige Samples

Differenzielle Expressions Analyse (DEG)

Signifikant regulierte Gene

  • Sorafenib induziert deutlich stärkere genomweite Antwort im Vergleich zu Trametinib.
  • Über 3500 Gene sind durch Sorafenib signifikant verändert (davon mehrheitlich herunterreguliert).
  • Trametinib führt nur zu moderaten Veränderungen mit deutlich weniger diff. expr. Genen.

→ Sorafenib hat breiteren Einfluss auf zelluläre Signalwege und Genexpression.

Gemeinsam regulierte Gene

  • Sorafenib wirkt deutlich stärker auf die Genexpression
  • Trametinib zeigt eine deutlich schwächere Wirkung

  • Sorafenib wirkt deutlich stärker auf die Genexpression
  • Trametinib zeigt eine deutlich schwächere Wirkung

Signifikanz einzelner Gene

  • ↑↑ CDX2, BMF, PCK1, CDKN1B
    Zellzyklushemmung, Förderung von Apoptose
  • ↓↓↓ TNS4, MYC, FOSL1, SPRY4, IER3
    Hemmung von onkogenen Programmen

  • ↑↑ BMF, CYP1A, ASCL2
    Zellulärer Stress bzw. Schadensantworten
  • ↓↓↓ TNS4, IER3, FOSL1
    MAPK-assoziierte Proliferation, Stressantworten und zelluläre Bewegung

Gene Set Enrichment (GSE) and KEGG Pathway Analyse

Signalwege

Gemeinsame Signalwege

Gemeinsame Signalwege

Transkriptionale Veränderungen

durch Sorafenib

⇓ Zellzyklus und Proliferation (MYC, E2F, G2M, KRAS, mTORC1)

⇓ Zellüberleben und Entzündungsreaktion (NF-κB-, IL2/STAT5-, TNFα-Signale)

⇑ Apoptose und Tumorsuppression (p53)

⇑ Metabolische Stressantworten: Adipogenese, Peroxisomen

⇑ Xenobiotik-Metabolismus

⇑ Interferon-Antwort (Hinweis auf Immunaktivierung oder zellulären Stress)

durch Trametinib

⇓ MAPK-getriebene Proliferation (KRAS, MYC, E2F, TNFα/NF-κB, IL6/STAT3)

⇓ Entzündungswege (akute Suppression von IL6/NF-κB)

⇑ P53-abhängige Stressantwort Zellzyklusarrest, p21, DNA-Reparatur aktiviert

⇑ Metabolische Stressantwort (Adipogenese)

⇑ Notch- und STAT3-Aktivierung ⇒ Hinweis auf Resistenzentwicklung, Aktivierung kompensatorischer Signalwege

Gene Ontology Analyse

  • Stoffwechselprozesse: Lipidabbau, Phospholipid- und Fettsäuremetabolismus
  • Oxidativer Stress und Fremdstoffe (Xenobiotika).
  • Autophagie, Insulinantwort und Proteinabbau.
  • Metabolische Reprogrammierung und aktiviert zelluläre Schutzmechanismen

  • Gezielte Hemmung von Genen der Proteinbiosynthese
  • Weitere Prozesse: Nuklearer Transport, mRNA-Splicing, Kinaseaktivität, Apoptose-Regulation
  • Sorafenib hemmt zentrale Zellfunktionen (Translation, Signalweiterleitung, Zellwachstum), unterstützt seine antitumorale Wirkung

  • Signifikante Anreicherung in Prozessen der Organ- und Systementwicklung
  • Beeinflusst auch intrazelluläre Rezeptorsignalwege, Vitaminantwort, Differenzierung vaskulärer glatter Muskelzellen
  • Trametinib beeinflusst zentrale Entwicklungs- und Regulationsmechanismen in Geweben

  • Beeinflussung von Phosphorylierung und Kinaseaktivität
  • Verminderte Epithelzell-Proliferation, Apoptose-Regulation, Proteintransport in den Zellkern
  • Trametinib hemmt zentrale zelluläre & entwicklungsbezogene Prozesse und trägt zur Tumorwachstumshemmung bei

Weiterführende Analysen

  1. Integration mit Mutationsdaten (Variant Calling)

    • DEG-Analyse getrennt pro Gruppe und vergleichen
    • Gibt es unterschiedliche DEGs zwischen mutierten und Wildtyp-Gruppen?

  2. Deep Learning für Drug Response Prediction

    • Nutze DEGs (oder Genexpressionsprofile insgesamt) kombiniert mit anderen Omics-Daten (Mutationen, etc.) als Input und trainiere neuronale Netze
    • Vorhersage von Therapieresistenzen/Sensitivitäten

  3. Integration von DNA-Methylierung

    • Epigenetische Kontrolle beeinflusst Genexpression und kann DEGs erklären.
    • Vergleiche Methylierungsmuster in Promotorregionen der DEGs
    • Finde Gene mit korrelierter Hypermethylierung & Downregulation (Hinweis auf epigenetische Silenzierung)
    • Nutzung von Tools wie MethylKit oder minfi.

Vielen Dank für Eure Aufmerksamkeit!




Code Repositories

Referenzen